Cambios en la ultraestructura de la retina externa en pacientes con degeneración macular asociada a la edad (DMAE) exudativa tratados con aflibercept. Estudio piloto de exosomas circulantes en plasma de sujetos sanos y pacientes con DMAE exudativa

Abstract

La DMAE constituye la primera causa de ceguera en los países industrializados y dada su relación con el proceso de envejecimiento en los próximos años se prevee un gran aumento de su incidencia.1 Los fármacos anti - VEGF, entre los que se incluye el aflibercept, son en la actualidad el tratamiento gold - standard para tratar esta patología.5-9 Con el objetivo de reducir la sobrecarga asistencial - en visitas y tratamiento - que supone el tratamiento mensual, se han diseñado diferentes estrategias de tratamientos, entre las que se incluye la pauta TE.2-9 Por otro lado, el creciente desarrollo de las técnicas de imagen ha permitido el descubrimiento de hallazgos anatómicos útiles como elementos diagnósticos y de monitorización. Nuestro trabajo consistirá en la evaluación de la eficacia de un año de tratamiento en pauta TE con aflibercept en pacientes con DMAE exudativa naive, analizando si existen cambios en los parámetros morfológicos retinianos, en la ganancia visual y en el número de inyecciones o visitas requeridas en función de una subclasificación multimodal de los complejos neovasculares. De forma paralela, en los últimos años, se está adquiriendo solidez científica sobre la implicación de los exosomas (microvesículas extracelulares con importantes funciones de comunicación celular) en la patogenia de la DMAE.10-14 Realizaremos, así mismo, un estudio piloto en el que se cuantificará el número de exosomas plasmáticos circulantes CD9RPE65 en dos poblaciones de pacientes: en pacientes sanos y en pacientes con DMAE exudativa.

1. Valorar la eficacia de un protocolo de tratamiento de TE en pacientes con DMAE y realizar un subanálisis del número de inyecciones y / o visitas requeridas según el subtipo de complejo neovascular. 2. Estudiar los cambios en la ultraestructura externa de la retina y de los parámetros exudativos a lo largo del tratamiento en los distintos subtipos neovasculares. 3. Identificar factores pronósticos anatómicos y funcionales en los subtipos neovasculares. 4. Analizar la existencia de cambios en el grosor coroideo con el tratamiento con aflibercept. 5. Realizar un aislamiento y una cuantificación de exosomas circulantes CD9RPE65 en pacientes sin enfermedad retiniana y en pacientes con DMAE exudativa de reciente diagnóstico y comparar los resultados obtenidos. Se realizará un estudio prospectivo sobre 37 pacientes con membranas neovasculares secundarias a DMAE que no hayan recibido tratamiento previo en el ojo afecto tratados con aflibercept en régimen de "tratar y extender". En relación con los objetivos 1-4 se realizarán 4 análisis puntuales; uno en condiciones basales previo al inicio de tratamiento; otro a las 3 y 6 meses del mismo y un último al finalizar el año de seguimiento. Los datos socio-demográficos y oculares y la angiografía fluoresceínica se registrarán en condiciones basales. Los resultados se anotarán en un cuaderno de recogida de datos realizado con anterioridad al inicio del estudio. Los pacientes se identificarán en dicho cuaderno en base a una numeración correlativa precedida por el código VC-0, siendo el investigador principal el único con capacidad de correlacionar al paciente con dicho código e imposibilitando de esta manera su identificación por terceras personas. Gran parte de nuestros objetivos se basan en el análisis y evaluación de pruebas diagnósticas objetivas y subjetivas. A continuación detallamos las que se consideran de mayor relevancia: - Los datos sociodemográficos y de comorbilidades se recogerán en una entrevista clínica basal y los hallazgos oculares mediante el examen en lámpara de hendidura. - La agudeza visual se tomará conforme a lo establecido en el Early Treatment Diabethic Retinopathy Chart - La evaluación cuantitativa de las capas EZ y membrana limitante externa de la retina externa y el grosor coriocapilar se realizará mediante tomografía de coherencia óptica de dominio espectral. (SD- OCT) (3D OCT-2000 Spectral Domain OCT, Topcon Medical Systems, Inc., Oakland, USA) Bajo dilatación pupilar, se tomarán cortes horizontales del área macular. Con el apoyo de herramientas de software existentes en el aparato, se medirá la longitud de la capa de EZ y ELM 1 mm nasal y temporal a la fóvea. El grosor coroideo se evaluará a nivel subfoveal mediante la medida del grosor desde el EPR hasta la interfaz corio-escleral. Estas imágenes del área macular serán las empleadas para el análisis cuantitativo y cualitativo de otros parámetros como CMT, volumen macular, presencia de quistes intrarretinianos, líquido subretiniano o desprendimiento del EPR. - Los cambios producidos en el EPR, la presencia de atrofia y el tamaño de la misma se estudiará mediante el análisis manual, apoyado en herramientas de software IMAGEnet 2000R-2.59, (Topcon Corp.1996- 2006) de imágenes de autofluorescencia obtenidas con Topcon TRC-50IX Mydriatic Retinal Camera, (Topcon Medical Systems, Inc., Oakland, USA); correlacionando los hallazgos con datos presentes en imágenes de retinografía (Topcon TRC-50IX Mydriatic Retinal Camera, Topcon Medical Systems, Inc., Oakland, USA) en la misma localización. - El tipo, la localicación y el tamaño de la neovascularización coroidea se basará en datos aportados por angiografía fluoresceínica (Topcon TRC-50IX Mydriatic Retinal Camera, Topcon Medical Systems, Inc., Oakland, USA).

En relación con el objetivo de realizar un aislamiento y una cuantificación de exosomas circulantes CD9RPE65 en pacientes sin enfermedad retiniana y en pacientes con DMAE exudativa de reciente diagnóstico y comparar los resultados obtenidos.

Se realizará la toma muestral en dos grupos de pacientes, dentro de aquellos con consentimiento previo a la realización de los procedimientos invasivos, uno en pacientes sanos sin patología retiniana y otro en pacientes con DMAe exudatia naive previo al inicio de tratamiento con aflibercept.

En cuanto al protocolo de procesamiento muestral para la obtención y cuantificación de los exosomas se incluye: - Extracción muestral * Extracción de un volumen de sangre por paciente (9-18ml) en tubos de citrato sódico al 3,2% bajo condiciones de esterilidad, mediante el procedimiento de flebotomía convencional para la extracción de muestra de sangre periférica. * La muestra será etiquetada conforme a una numeración correlativa iniciada por el código VC-0 que únicamente conoce el investigador principal y que impida la identificación del paciente por otras personas. - Aislamiento de Exosomas: * Centrifugación de la muestra a 160xg durante 20 minutos con el fin de separar el componente plasmático. En caso de no poderse realizar, se realizará su almacenaje en nevera a 4º en posición horizontal garantizando un transporte en un período máximo de 3 horas hasta el laboratorio principal de análisis muestral localizado en la facultad de Medicina de la Universidad Católica de Valencia ( Calle Quevedo, nº 2, Valencia) según condiciones necesarias para el transporte de muestras biológicas humanas y realizado por personal integrante del laboratorio, para su inmediato procesamiento, no siendo necesario un banco de almacenamiento de tejidos biológicos. * Reclutamiento del componente plasmático y traspase del mismo a un tubo nuevo, anotando en el cuaderno de recogida de datos el volumen de plasma obtenido. * Centrifugación a 700xg durante 30 minutos a 15º. * Desechamiento del pellet y traspase del sobrenadante a un nuevo tubo que será centrifugado a 14.000xg durante 30 minutos. * Nuevo desechamiento del pellet y centrifugación del sobrenadante a 40.000xg durante 30 minutos. * Traspaso de sobrenadante a nuevo tubo que será centrifugado a 120.000xg durante 90 minutos. * Desechamiento final del sobrenadante y se guardará el pellet donde se encuentran los exosomas..

- Determinación y cuantificación de exosomas. * Comprobación mediante microscopía electrónica del correcto aislamiento de la estructuras exosómicas en base a parámetros morfológicos ( morfología típica entre 30-100nm). * Marcación mediante fluorometría e inmunocitoquímica de proteínas transmembrana presentes en los exosomas con origen en las células del EPR RPE-65-CD9 +.