Análisis de la mutación nt230(del4) del gen ABCB1 en perros

Abstract

La proteína Multidrug Resistance Protein 1 (MDR1) es un transportador de membrana que exporta fármacos desde el citosol al exterior celular. MDR1, que entre otras funciones limita el paso de fármacos a través de la barrera hematoencefálica desde la sangre hacia el sistema nervioso central, está codificada por el gen ABCB1 cuyo exón 4 puede presentar en perros la mutación nt230(del4). Esta mutación es una deleción de 4 pb que causa un cambio de pauta de lectura en el ARN mensajero, un codón de parada de traducción prematura y la aparición de una proteína truncada e inactiva. La mutación nt230(del4) se ha asociado a hipersensibilidad a fármacos como el antiparasitario ivermectina. En el presente trabajo, usando extractos de ADN genómico de perros, se ha evaluado un método de detección de la mutación nt230(del4), basado en PCR´s específicas de alelo, previamente descrito. Se comprobó que este método no resultaba fiable pues sus resultados no fueron confirmados por el análisis mediante secuenciación. Por eso se desarrolló un método alternativo de tipo RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), basado en PCR, digestión con enzimas de restricción y electroforesis en gel de poliacrilamida, que parece más apropiada que la anterior, y cuya puesta a punto está en curso. Finalmente, la secuenciación de 21 muestras de border collies y pastores alemanes solo permitió encontrar el alelo normal, apuntando a que el alelo mutante nt230(del4) es muy minoritario en las razas citadas en España, tal y como se había descrito previamente en otros países.

Multidrug Resistance Protein 1 (MDR1) is a membrane transporter that exports drugs from the cytosol to the extracellular milieu. MDR1, which among other functions limits the passage of drugs from the blood to the central nervous system through the blood-brain barrier, is encoded by the ABCB1 gene whose exon 4 in dogs may hold the nt230(del4) mutation. This mutation is a 4-bp deletion causing a frame-shift in the messenger RNA, a premature translation stop codon, and the appearance of a truncated, inactive protein. The nt230(del4) mutation has been associated with hypersensitivity to drugs such as the antiparasitic ivermectin. In the present work, using dog genomic DNA extracts, a previously described method for detecting nt230(del4) mutation based on allele-specific PCR´s has been evaluated. This method was found to be unreliable as its results were not confirmed by sequencing analysis. For this reason, it was developed an alternative RFLP (restriction fragment length polymorphism) method based on PCR, digestion with restriction enzymes and polyacrylamide gel electrophoresis, that is apparently more adquate than the prior one, and whose fine-tuning is ongoing. Finally, the sequencing of 21 samples of border collies and German shepherds only allowed to find the normal allele, pointing out that the mutant allele nt230(del4) is scarce in the above mentioned breeds in Spain, as it had been discovered before in other countries.