Fases preliminares para el estudio de la activación de la transcripción dependiente del factor de transcripción cianobacteriano NtcA

Abstract

La regulación transcripcional del metabolismo del nitrógeno en cianobacterias está mediada mayoritariamente por el factor de transcripción NtcA, perteneciente a la familia CRP-FNR. Este factor de transcripción se une específicamente a secuencias consenso del promotor facilitando el reclutamiento de la RNA polimerasa (RNAP) al lugar de inicio de la transcripción. NtcA adopta su conformación activa compatible con la unión a DNA cuando une 2-oxoglutarato, que es un metabolito cuyos niveles aumentan en situaciones de pobreza de fuentes nitrogenadas. En condiciones en las que la concentración de nitrógeno es muy baja, la proteína PipX actúa como coactivador de la transcripción uniéndose y estabilizando la forma activa de NtcA. Se desconoce a nivel molecular tanto el modo en el que el complejo NtcA-PipX interacciona con la RNAP y los diferentes promotores, como el mecanismo por el cual activan la transcripción. El objetivo global de este proyecto en el laboratorio de acogida es comprender esta interacción estudiando la estructura del complejo NtcA-PipX-Promotor-RNAP mediante criomicroscopía electrónica. Este proyecto de trabajo de fin de grado se enmarca dentro de este objetivo global y en él se ha pretendido dar los primeros pasos para la obtención de la RNAP de la cianobacteria Synechococcus elongatus de forma recombinante en Escherichia coli, usando para ello vectores de coexpresión que porten los genes que codifican las distintas subunidades de la RNAP. Además se han expresado y purificado las proteínas NtcA y PipX.

Transcriptional regulation of nitrogen metabolism in cyanobacteria is mainly mediated by NtcA, a transcription factor which belongs to the CRP-FNR family. NtcA specifically binds to consensus promoter sequences facilitating the recruitment of RNA polymerase (RNAP) to the transcription start site. NtcA adopts its active conformation compatible with DNA binding when bound to 2-oxoglutarate, a metabolite whose levels increase when nitrogen sources levels are low. Moreover, under conditions in which the nitrogen concentration is very low, the PipX protein acts as a coactivator of transcription, binding and stabilizing the active form of NtcA. The way in which the NtcA-PipX complex interacts with the RNAP and the different promoters, as well as the mechanism by which they activate transcription, is unknown at molecular level. The main objective of the project in the host laboratory is to understand this interaction studying the structure of the NtcA PipX-Promoter-RNAP complex using cryo-electron microscopy. This end-of-degree work project is part of this global objective, and the main purpose has been to take the first steps to obtain a recombinant RNAP from the cyanobacteria Synechococcus elongatus, using co-expression vectors that carry the genes that encode the different subunits of RNAP. Furthermore, we have expressed and purified the proteins NtcA and PipX.