Utilidad de un anticuerpo “custom” para la detección específica de una nueva isoforma de 70 kDa de la enzima RNasa L

Abstract

La enzima RNasa L es una endoribonucleasa en estado latente que está presente en una gran variedad de tipos celulares de mamíferos, y cuya función principal es su actividad antiviral como respuesta a la presencia de interferones (IFN) al detectar la presencia de un patógeno. En el genoma humano está codificada por el gen RNASEL y su activación desencadena la degradación de todo tipo de ARN tanto celular como viral. La enzima presenta un tamaño aproximado de 83 kDa pero evidencias recientes obtenidas por el grupo de la Dra. Elisa Oltra indican la posibilidad de que exista una nueva isoforma de 70 kDa en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de pacientes de encefalomielitis miálgica/síndrome de fatiga crónica (EM/SFC). Para confirmar esta hipótesis se llevó a cabo la producción de distintos constructos de expresión conteniendo ambas isoformas, a utilizar en transfecciones de células humanas HEK-293T para su producción in vitro, y de esta forma, conocer el funcionamiento de un anticuerpo “custom” (POLY 33) obtenido en conejos con un péptido sintético de 17 aminoácidos exclusivo de la nueva isoforma de 70 kDa mediante ensayos western blot. Esta investigación pretende confirmar el funcionamiento de este anticuerpo específico “custom” en relación con otros comerciales no específicos de isoforma, así como confirmar la existencia de esta nueva isoforma en muestras de pacientes. La importancia reside en que la nueva isoforma podría constituir un biomarcador de la EM/SFC y el anticuerpo “custom” proporcionar una herramienta de ensayo.

The RNase L enzyme is a latent endoribonuclease that is present in a wide variety of mammalian cell types, and whose main function is its antiviral activity in response to the presence of interferons (IFN) when there is presence of a pathogen. In the human genome it is encoded by the RNASEL gene and its activation triggers the degradation of all types of RNA, both cellular and viral. The enzyme is approximately 83 kDa in size but recent evidence obtained by Dr. Elisa Oltra's group indicates the possibility of the existence of a new 70 kDa isoform in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from patients with myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome (ME/CFS). To confirm this hypothesis, different expression constructs containing both isoforms were produced to be used in transfection of human HEK-293T cells for in vitro production, and in this way, get to know the performance of a "custom" antibody (POLY 33) obtained in rabbits with a synthetic peptide composed of 17 amino acids exclusive of the new 70 kDa isoform by western blot assays. This research aims to confirm the performance of this "custom" specific antibody relative to other commercial non-isoform specific antibodies, as well as to confirm the existence of this new isoform in patient samples. The importance lies in the fact that the new isoform could constitute a biomarker for MS/CFS and the custom antibody could provide an assay tool.