Profile of retinal pigment epithelium response to ethanol: Role of CYP2E1

Abstract

El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es esencial para la visión. Como parte de la barrera hematorretiniana (BRB) su papel principal es el mantenimiento de la homeostasis de la retina y coroides. El alcohol se ha convertido en la droga adictiva más aceptada por la sociedad causando problemas de salud, sociales y económicos. El estrés oxidativo (OS) inducido por etanol (EtOH) genera toxicidad celular aumentando la aparición de especies reactivas del oxígeno (ROS) que activan respuestas en el organismo como pueden ser inflamación y muerte celular. El enzima citocromo p450 2E1 (CYP2E1) tiene una alta afinidad por el EtOH. Su actividad es la principal fuente de ROS durante la oxidación del EtOH por las células. A pesar de que el CYP2E1 ha sido identificado en el RPE humano y que podría jugar un papel fundamental en la función del ciclo visual del RPE, no se conoce nada sobre su regulación y la respuesta celular que desencadena. Nuestro objetivo fue estudiar el rol del CYP2E1 en el RPE, en respuesta al tratamiento con EtOH. Fueron empleadas células ARPE-19, hRPE y hiPSC-RPE como modelos de RPE. Simultáneamente al EtOH, se realizaron tratamientos con DAS (inhibidor específico del CYP2E1) y con NAC (como antioxidante) para bloquear el efecto del EtOH en las células. Se realizaron estudios de viabilidad y citotoxicidad con EthD-1, calcein y XTT. El ROS intracelular y los aniones superóxido fueron cuantificados usando sondas fluorescentes (DCF y DHE respectivamente). Los marcadores de estrés celular, angiogénesis e inflamación fueron determinados con kits de expresión proteica. La integridad de la función de la barrera formada por el RPE se determinó midiendo la resistencia eléctrica transepitelial (TER) y el estado de las uniones intercelulares por inmunofluorescencia (IF). Se utilizaron western blot (WB), qPCR, IF y ELISA para cuantificar la expresión del CYP2E1 y los principales factores y moléculas liberadas por el RPE. La actividad del CYP2E se midió mediante HPLC. El EtOH aumentó los niveles ROS en las células del RPE, dando lugar a la muerte celular por apoptosis. Provocó una disfunción del RPE disminuyendo la integridad de las uniones intercelulares y modificando el perfil de expresión y liberación de factores de crecimiento, inflamación y angiogénesis. El EtOH aumentó la expresión del CYP2E1. El uso de DAS y NAC revirtió el daño causado en la células del RPE revelando que el CYP2E1 en el RPE estaría regulado por el OS. Finalmente, la presencia del CYP2E1 refuerza el papel protector del RPE y sugiere otros roles diferentes del CYP2E1 relacionados con la degeneración del RPE.