Role of extracellular vesicles in retinitis pigmentosa

Abstract

Retinitis pigmentosa (RP), an inherited degenerative retinal disease, is associated with progressive photoreceptor degeneration, which leads eventually to blindness. To date, the precise mechanisms leading to cell death remain unknown and no adequate treatment is available. Poly ADP ribose polymerase (PARP) over activity is involved in photoreceptor degeneration and, in mice models, its pharmacological inhibition protects the retina. Additionally, retinal cell survival depends of adequate reception and processing of the information and appropriate cellular communication. Initially, the extracellular vesicles (EVs) were recognized as a mechanism for discharging useless cellular components. Growing evidence has elucidated their roles in cell–cell communication by carrying nucleic acids, proteins, and lipids that can, in turn, regulate behavior of target cells. Nevertheless, the role of EVs in blinding diseases, such a RP, is far from being understood. The present project aims to investigate the EVs implication in retinal degeneration, including their release and cargo, their influence in neighboring cells, and the relationship with PARP activity in the retina. Rd1 and Rd10 mice - two well-known animal model for RP, which hold a mutation in the beta subunit of the phosphodiesterase 6 gene (PDE6) – helped advanced the understanding of the retinal degeneration. Section from rd1 and rd10 mice and organotypic retinal explants from rd10 were used to investigate cellular communication by EVs. CD9 and CD81 tetraspanins were studied to investigate EVs activity at tissue level by immunostaining. Inhibition of PARP activity was performed using Olaparib. Immunohistochemistry was carried out to evaluate PARylated proteins and immunostaining was performed to determinate rhodopsin (rho) expression, Müller glia cell activity, and cyclic guanosine monophosphate (cGMP) levels after olaparib treatment. Also, inmunofluorescence was used to study EVs and their colocalization with cilia in rd10 retinae after PARP inhibition. EVs were isolated using ultrafiltration and size exclusion chromatography or a commercial isolation kit, depending on downstream applications. Nanosight analysis, electron microscope, Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACs), dot blot, and proteomics were used to characterize the EVs. Moreover, rd10 retinas were treated with EV from wt and vice-versa. Inmunostaining assays against CD9, CD81, rho, and IBA-1 (microglia marker) were carried out after EVs treatments. TUNEL assay was used to evaluate cell viability, thickness, and row photoreceptor number in the outer nuclear layer (ONL) after Olaparib and EVs treatments. EVs release changes with the age in wt mice and also under retinal degeneration in rd1 and rd10 in different retinal layers. PARP inhibition by Olaparib rescues photoreceptors and also modify the EVs release and cargo in rd10 mice. The EVs release was increased in rd10 retinae and the protein cargo was modified under retinal degeneration. Moreover, EVs from rd10 retinae had the ability to damage wt retinas and something similar was produced after treated rd10 retinae with EVs from wt. This data strongly suggests the implication of EVs in retina development and degeneration.

Retinitis pigmentosa (RP) es una enfermedad hereditaria de la retina que produce degeneración progresiva de los fotorreceptores, generando ceguera. Hasta la fecha, los mecanismos precisos que conducen a la muerte celular son desconocidos y no existe un tratamiento adecuado. La sobreactividad de la Poli ADP-ribosa polimerasa (PARP) se encuentra implicada en la degeneración de los fotorreceptores y, en modelos animales, se ha observado que inhibición de PARP protege la retina. Además, la supervivencia celular de la retina depende de una adecuada recepción y procesamiento de la información y de una apropiada comunicación celular. Inicialmente, las vesículas extracelulares (VEs) fueron descritas como un mecanismo para eliminar componentes celulares inútiles. La creciente evidencia ha aclarado su papel en la comunicación celular, transportando ácidos nucleicos, proteínas y lípidos que pueden, a su vez, regular el comportamiento de las células diana. Sin embargo, el papel de las VEs en las enfermedades que cursan con ceguera ceguera, como la RP, está lejos de ser entendido. El presente proyecto tiene como objetivo investigar la implicación de las VEs en la degeneración de la retina, incluida su liberación y carga, su influencia en las células vecinas y la relación con la actividad de PARP. Los ratones Rd1 y Rd10, dos modelos animales de RP, que contienen una mutación en la subunidad beta del gen de la fosfodiesterasa 6 (PDE6), han sido de gran ayuda para entender como degenera la retina en la RP. Cortes de ratones rd1 y rd10 y cultivos organotípicos de retina de ratones rd10 se usaron para investigar la comunicación celular mediante VEs. Se estudió a expresión de las tetraspaninas CD9 y CD81 para investigar la actividad de las VEs a nivel retiniano. Para inhibir la actividad de PARP se realizó usando Olaparib. La inmunohistoquímica se llevó a cabo para evaluar las proteínas PARiladas y la inmunotinción se empleó para determinar la expresión de rodopsina (rho), la actividad de las células de Müller y el nivel de guanosín monofosfato cíclico (GMPc) después del tratamiento con olaparib. Además, se utilizó inmunofluorescencia para estudiar las VEs y su colocalización con cilios en retinas rd10, tras la inhibición de PARP. Las VEs fueron aisladas mediante ultrafiltración y cromatografía de exclusión por tamaño o con un kit de aislamiento comercial, dependiendo de las aplicaciones posteriores. Para caracterizar las VEs se utilizó la técnica Nanosight, microscopía electrónica, citometría de flujo (FACs), dot blot y proteómica. Además, las retinas rd10 se trataron con VEs de wt y viceversa. La inmunotinción frente a CD9, CD81, rho e IBA-1 (marcador de microglia) se llevó a cabo después de los tratamientos con VEs. El ensayo TUNEL se utilizó para evaluar la viabilidad celular, el grosor y el número de fotorreceptores en la capa nuclear externa después de los tratamientos con Olaparib y VEs. La liberación de VEs cambia con la edad en ratones wt y también bajo degeneración retiniana en rd1 y rd10 en diferentes capas retinianas. La inhibición de PARP por Olaparib rescata fotorreceptores y también modifica la liberación y carga de las VEs en ratones rd10. La liberación de VEs aumentó en las retinas rd10 y el cargo proteico se modificó con la degeneración de la retina. Además, las VEs de las retinas rd10 presentaron la capacidad de dañar las retinas wt y se produjo algo similar después de que las retinas rd10 fueran tratadas con las VEs de wt. Estos datos sugieren la implicación de las VEs en el desarrollo y la degeneración de la retina.